phi X 174. Помимо того, что это был первый секвенированный ДНКовый вирус, почти тридцать лет назад другая команда уже сделала примечательную и успешную попытку скопировать этот одноцепочечный геном с помощью ферментов.
Глава 5. Синтетический phi X 174
Это будет одна из самых важных историй, которые когда-либо читали вы, или ваш папа, или ваш дедушка… Эти люди открыли фундаментальный секрет жизни. Это потрясающее достижение. Оно широко распахивает двери к новым открытиям в борьбе с болезнями, в строительстве намного более здоровой жизни для всех людей. Это может быть первым шагом – как говорят эти великие гении из лаборатории – к контролю над некоторыми видами рака в будущем.
Хотя большинство людей никогда не слышали о phi X 174, этот простой бактериофаг уже завоевал место в истории. Фаг был первым ДНКовым вирусом, подвергшимся секвенированию, и первым, чей геном искусственно скопировали и активировали. Найденный в парижской канализации{103}phi X 174 поражает бактерию из человеческого кишечника E. coli. Можно удивиться, почему так много внимания уделено такому вроде бы неприметному вирусу, но причина проста: в этом вирусе, если изучать его на молекулярном уровне, почти ничего нет. Phi X 174 состоит из хромосомы – кольцевой молекулы ДНК, в которой всего 11 генов, – упакованной в икосаэдрическую «одежку» из белков, включая дюжину пятиугольных «шипов». Хотя под электронным микроскопом фаг выглядит красивым, как цветок, на самом деле это холодная геометрическая форма. Вирус не живее кристалла соли. Его жизненный цикл таков: фаг впрыскивает свою ДНК в бактериальную клетку, где она перехватывает управление биохимической машиной клетки, заставляя ее производить множество новых вирусов. Затем потомство вырывается из клетки, будучи готово заразить еще больше бактерий E. coli.
До появления секвенирования ДНК и даже до того, как стало известно строение генома фага, вирус в 1960 году воссоздала в лаборатории Стэнфордского университета группа под руководством биохимика Артура Корнберга. Ключом к этому достижению стало открытие Корнбергом ДНК-полимеразы, главнейшего фермента для репликации ДНК. Лаборатория Корнберга, используя новооткрытый фермент, начала копировать ДНК in vitro. Судя по статьям Корнберга, его команда сначала попыталась скопировать бактериальный геном, но успеха не имела из-за неспособности полимеразы прочесть безостановочно насквозь весь геном, который состоит из миллионов оснований ДНК.
После провалившегося эксперимента Корнберг решил сделать то, что тридцать лет спустя собиралась сделать моя группа: он поставил себе целью воспроизвести какую-нибудь ДНК попроще, а именно phi X 174. К тому времени один из первопроходцев в генном синтезе и секвенировании, Роберт Синшаймер открыл некоторые важные детали в жизненном цикле фага. Хотя ДНК вируса phi X 174 состоит из одной кольцевой цепочки, Синшаймер обнаружил, что немедленно после заражения хозяина ферменты бактерии превращают кольцевую ДНК в привычную линейную двойную спираль. Это открытие высветило проблему, с которой столкнулся Корнберг при попытках сделать копию вирусного генома: хотя ДНК-полимераза может скопировать весь геном phi X 174 (5386 пар оснований) в линейной форме, она не может создать инфекционную кольцевую форму. Мы все знаем, как превратить линию в окружность, но сделать это на молекулярном уровне полвека назад было для ученых не так просто.
Природа, конечно, превзошла мастерство, и несколько групп ученых, включая команду Корнберга, стали искать бактериальный фермент, который мог бы соединить два конца линейной двухцепочечной ДНК, чтобы превратить ее в замкнутую окружность, наподобие молекулярного уробороса. Этот поиск завершился в 1967 году, когда пять групп открыли ДНК-лигазу – фермент, который мог замкнуть ДНК в колечко. К концу года Корнберг использовал ДНК-лигазу для соединения концов ДНК phi X 174, скопированной ДНК-полимеразой. Воспроизведенная ДНК теперь могла заразить бактерию. Вот так Корнберг преуспел в копировании генома phi X 174, закольцевав его, использовав ферментативно скопированную ДНК для заражения E. coli и продуцирования множества копий этого вируса.
Он, конечно, знал в общих чертах свой объект, но не знал состава генома phi X 174 – последовательности ДНК. Корнберг понял, что он «оживил», лишь спустя десять лет, в 1977 году, когда группа Фреда Сэнгера использовала ДНК-полимеразу в своем новом методе секвенирования, применив ее к геному phi X 174. Тем не менее работа Корнберга стала сенсацией. 14 декабря 1967 года Стэнфордский университет организовал пресс-конференцию Корнберга, приурочив ее к публикации его статьи в журнале Proceedings of the National Academy of Sciences. Организаторы попросили журналистов не называть его достижение «синтетической жизнью», поскольку вирусы – не живые существа; они могут размножаться только при помощи других организмов. Но, как оказалось, предупредили не всех.
В тот же день президент Линдон Джонсон должен был произнести речь в Смитсонианском институте на праздновании двухсотлетия Encyclopaedia Britannica{104}, и его спичрайтер попросил Стэнфорд дать ему абзац про работу над ДНК. Просьба была выполнена, но когда Джонсон начал читать подготовленную речь, он резко отложил ее в сторону и не смог сдержать волнения, рассказывая аудитории о новостях, которые вот-вот должны были появиться в газетных шапках:
Это будет одна из самых важных историй, которые когда-либо читали вы, или ваш папа, или ваш дедушка… Эти люди открыли фундаментальный секрет жизни. Это потрясающее достижение. Оно широко распахивает двери к новым открытиям в борьбе с болезнями, в строительстве намного более здоровой жизни для всех людей. Это может быть первым шагом – как говорят эти великие гении из лаборатории – к контролю над некоторыми видами рака в будущем.
Президент также рассмотрел ситуацию, когда государство может «учреждать жизнь», обладая властью, которую раньше считали прерогативой природы или даже бога: «Это, наверное, станет одной из великих проблем – и одним из важнейших решений. Те решения, что принимает нынешний президент, – это детский сад по сравнению с теми, которые предстоят будущему президенту». После такой речи неудивительно, что заголовки газет по всему миру провозгласили рождение первой синтетической жизни{105}.
Мне посчастливилось ознакомиться с приведенным выше пассажем о «тайне жизни» на десятки лет позже – в 2010 году, когда мы объявили о первой синтетической клетке и научный журналист Джо Палка готовил интервью со мной для Национального общественного радио. (История, которую президент приветствовал как самую важную на поколения вперед, прошла мимо меня – в дни, когда это было главной новостью, я служил санитаром во флотском госпитале в Дананге, во Вьетнаме.) Я подумал, что эта забавная история – восхитительная находка, прекрасно иллюстрирующая как преемственность научного мышления – в данном случае в деле полного понимания жизни путем ее воссоздания, – так и неизбежные трудности донесения до публики действительно волнующих научных результатов без преувеличения и срыва в рекламу. Я когда-то знал Корнберга через руководителя моей диссертации Натана (Нэйта) Каплана. Я задумался: что сделал бы Корнберг, будь в его распоряжении те замечательные возможности геномики, что последовали за его ранними экспериментами?
Опыты с воссозданием ДНК-вирусов на матрице оригинального вирусного генома позже были распространены на более примитивные РНК-вирусы, такие как вирус полиомиелита, и на ретровирусы – такие как ВИЧ. У последних носителем наследственности тоже служит РНК, но они дублируют ее в геном клетки-хозяина с помощью фермента, переписывающего РНК на ДНК. Открытие этого фермента – обратной транскриптазы – в 1970 году стало результатом исследования опухолеродных РНК-вирусов и сильно поколебало центральную догму «ДНК→РНК→белок». За независимое открытие обратной транскриптазы Ховард Мартин Темин из Университета Висконсина в Мэдисоне и Дэвид Балтимор из Массачусетского технологического института (МТИ) поделили Нобелевскую премию 1975 года по физиологии и медицине.
Среди РНК-вирусов есть и бактериофаги; один из них, фаг Qβ (Ку-бета), был первым вирусом, воссозданным в лаборатории с помощью обратной транскриптазы. Этот опыт был кульминацией замечательной работы швейцарского молекулярного биолога Чарльза Вайссмана, который, вероятно, больше известен своими исследованиями прионов в Цюрихском университете и получением белка интерферона с применением технологии рекомбинантной ДНК в 1980 году, через несколько лет после основания первой биотехнологической компании Genentech{106}. Ранние новаторские попытки Вайссмана и Мартина Биллетера секвенировать РНК в 1969 году{107} воодушевят Фреда Сэнгера{108}. Позже, работая с Ричардом Флоуэллом, Вайссман в 1974 году проложит путь к тому, что сегодня называют «обратной генетикой»: изучению того, как влияют на организм те или иные изменения генетического текста (в противоположность классической генетике, где выявляют мутантный организм, а затем прослеживают ответственную за это мутацию в ДНК).
В том же 1974 году начался и прогресс в копировании РНК-вирусов, когда Вайссману и Тадацугу Танигучи удалось получить комплементарную двухцепочечную ДНК-копию (кДНК) с РНК фага Qβ, которую потом они вставили в плазмиду-переносчик. К «удивлению и радости» Вайссмана, плазмида, внедренная в