Deinococcus переживать такую атаку? И нельзя ли приспособить те же механизмы репарации ДНК для построения синтетического генома?
Действие радиации на белки и ДНК всех видов примерно одинаково и отчасти связано с размером молекул. В начале своей научной карьеры я посвятил некоторое время определению размеров белков, инактивируя их радиацией. Методика в принципе проста. В белках радиация разрывает пептидные связи, которые соединяют составляющие белок аминокислоты; одного попадания в молекулу белка достаточно, чтобы лишить ее активности. Существует обратная зависимость между размером молекулы белка и дозой радиации, нужной для его инактивации путем разрыва пептидных связей (шанс попасть в крупную мишень гораздо выше, чем в мелкую), поэтому чем меньше белок, тем большая доза радиации нужна. Я использовал этот метод для определения размера белков-рецепторов нейромедиаторов и их функциональных комплексов{136}.
Сходным образом радиация поражает и ДНК, разрывая химические связи, соединяющие нуклеотиды между собой. Как и в случае с белками, чем больше геном, тем ниже доза радиации, способная причинить разрушения. Из-за нашего большого генома люди намного чувствительнее к воздействию радиации, чем бактерии. Геном человеческой клетки в тысячу раз больше генома микроба: шесть миллиардов пар оснований против 1–8 миллионов пар у бактерий. Вследствие этого, чтобы разорвать обе цепочки в нашей ДНК, нужна значительно меньшая доза радиации, чем для бактериальной хромосомы. Поэтому мы можем быть уверены, что если нас угораздит попасть под ядерный армагеддон, то мелкие формы жизни его выдержат.
Так как выживает Deinococcus? Подвергаясь миллионам рад радиации, геном Deinococcus разбивается на сотни двухцепочечных обломков ДНК, но эти бактерии могут чинить и заново собирать свои хромосомы и продолжать реплицироваться. Его способность проделывать такое до сих пор полностью не понята, но в нее входят, в частности, множество копий каждой хромосомы, так что, когда его ДНК оказывается разорвана радиацией во множестве случайных мест, получившиеся фрагменты могут сами выстраиваться в нужном порядке, образуя матрицу ДНК. Я часто уподоблял этот процесс тому, который мы использовали в секвенировании дроблением, когда программа на мощном компьютере заново собирает секвенированные перекрывающиеся фрагменты ДНК, восстанавливая геном.
Мы рассудили, что если бы нам удалось воспроизвести процессы починки ДНК и сборки хромосом вне клеток Deinococcus, то мы могли бы использовать это для сборки нашей синтетической хромосомы из больших, размером с вирусный геном, сегментов ДНК. Двое наших сотрудников, Санджай Ваши и Рэйюань Чуан (Sanjay Vashee и Ray-Yuan Chuang), согласились заняться этой работой. Они перебрали весь геном Deinococcus в поисках всех генов, которые могли иметь отношение к делу, затем провели еще два года, клонируя каждый ген, чтобы получать «ремонтные» белки в лаборатории, где их можно было комбинировать так и сяк для повторения сборки и ремонта ДНК. После тяжких трудов мы были вынуждены сдаться. Мы уперлись в тупик и нуждались в новой стратегии.
Следующим подходом было разработать логичный пошаговый план сборки. Применяя специально предусмотренные перекрывания в последовательностях ДНК соседних кассет, мы собрали «в пробирке» две кассеты, чтобы получить фрагмент побольше. Затем мы клонировали этот более крупный фрагмент в E. coli, чтобы при ее размножении множились бы и копии крупного фрагмента. Таким путем мы могли получить достаточно много ДНК для следующего этапа сборки. Нашей конечной целью было не только получить геном M. genitalium, но и разработать продуктивный воспроизводимый процесс сборки, который мы в дальнейшем могли бы приложить к созданию любых синтетических геномов.
Наш план первого раунда сборки генома состоял в соединении четырех кассет, каждая размером примерно с геном phi X 174, чтобы создать кусок в 24 000 пар оснований. Для этого мы внесли равные количества каждой из четырех кассет в микроцентрифужную пробирку с векторной ДНК, позволявшей размножить этот свежесобранный сегмент в E. coli. Вектор, который мы использовали, называется искусственной бактериальной хромосомой (ИБХ). В ней один конец перекрывается с началом кассеты № 1, а другой – с концом кассеты № 4.
Чтобы связать куски вместе, мы добавили в смесь ДНК в пробирке фермент (3’-экзонуклеазу), который откусывает по нуклеотиду с конца ДНК, укорачивая лишь одну из двух цепочек ДНК (так называемую 3’-цепочку – это название связано с тем, как нумеруются атомы углерода в сахарах нуклеотидов ДНК) и оставляя другую цепочку (5’-цепочку) открытой. Управляя экзонуклеазой путем изменений температуры, мы могли гарантировать, что соответствующие одноцепочечные концы кассет найдут друг друга и слипнутся за счет химического притяжения комплементарных оснований на каждой цепочке, а-ля Уотсон и Крик.
Чтобы убедиться, что мы в итоге получим полные двуспиральные цепочки, мы затем добавили ДНК-полимеразу и свободные нуклеотиды, чтобы в любом месте, где 3’-экзонуклеаза откусила от цепочки слишком много, полимераза вставила недостающие основания на место. Кроме того, в смесь был добавлен еще один фермент, ДНК-лигаза, чтобы соединить перекрывающиеся концы. Когда все ферменты закончили свою работу, мы получили все четыре кассеты, сцепленные в куски из 24 000 пар оснований, или цепочки в 24 кб[18]. Чтобы произвести все такие «укрупненные» кассеты по 24 кб, которые вместе составляют полный геном M. genitalium, мы повторили процесс двадцать пять раз.
Так как мы размножали синтетическую ДНК в E. coli, то у нас было достаточно ДНК для секвенирования. После проверки секвенирования всех 25 кассет мы повторили процесс in vitro, на этот раз соединяя три кассеты по 24 кб в кассеты по 72 000 пар оснований, то есть каждая кассета составляла одну восьмую от генома M. genitalium. Чтобы сделать это, нам сначала надо было освободить (с помощью рестриктазы) кассеты по 24 кб от вектора-ИБХ, который использовался, чтобы растить их в E. coli.
Наши векторы-ИБХ были сконструированы так, что на обеих сторонах нашей вставленной синтетической ДНК у них была последовательность из восьми определенных оснований. Эта восьмерка нуклеотидов, не встречающаяся в естественном геноме M. genitalium, распознается особой рестриктазой, называемой NotI. Когда NotI разрезает ДНК ИБХ, синтетический фрагмент в 24 кб освобождается. На этом этапе мы получили синтетическую ДНК, длина которой более чем вдвое превышала предыдущий рекорд для синтетических ДНК-сборок.
Следующим шагом было повторение процесса еще раз, теперь для получения сегментов по 144 000 пар оснований, каждый сегмент – четверть генома. Для этого две кассеты по 72 кб подвергались тому же процессу сборки in vitro. Однако тут мы вступали на неизвестную территорию и доводили нашу методику до предела. На предпоследнем этапе – получении сегментов в половину генома (290 000 пар оснований) путем соединения четырех четвертей в две половинки – мы уперлись в проблему: сегменты по 290 кб оказались слишком большими для размещения их в E. coli.
Это побудило нашу команду начать поиски других видов, способных устойчиво вмещать столь большие молекулы синтетической ДНК. Мы обратили внимание на Bacillus subtilis, которую использовала японская группа для выращивания больших сегментов генома цианобактерий{137}. Но хотя B. subtilis действительно могла вместить большие сегменты по 290 кб, извлечь неповрежденную ДНК из этих клеток оказалось невозможно, так что мы стали искать дальше. Решение пришло из мира более сложных клеток – эукариот. Это был любимый экспериментальный объект ученых всего мира, изучающих биологию эукариот: пивные дрожжи Saccharomyces cerevisiae. Они веками применялись в виноделии и хлебопечении, а в лабораторной практике стали популярны благодаря относительно маленькому геному и ряду особенностей, облегчающих генетические манипуляции. Например, S. cerevisiae используют для так называемой гомологичной рекомбинации: если сегмент ДНК имеет на своих концах последовательности, сходные или идентичные концевым последовательностям какого-то участка в геноме S. cerevisiae, то этот сегмент можно вставить в геном дрожжей вместо «родного».
Нашим гуру по части дрожжей был Владимир Носков, научный сотрудник группы синтетической биологии и биоэнергетики в Институте Крейга Вентера в Мэриленде. Носков учился в Санкт-Петербургском государственном университете в России и потом продолжил образование там же, готовя диссертацию по генетике дрожжей. Проведя пять лет в Японии за изучением репликации хромосомальной ДНК и «контрольной точки» клеточного цикла дрожжей, где ДНК проходит контроль и починку, он затем работал в НИЗ в Бетесде. Там, в группе структуры и функции хромосом, Носков придумал несколько новых приемов для технологии манипулирования большими кусками ДНК в дрожжах – трансформационно-ассоциированного рекомбинантного (ТАР) клонирования, более совершенного, чем старый метод искусственных хромосом дрожжей (YACs).
Дрожжевые клетки, которые примерно в десять раз больше клеток E. coli, защищены толстой клеточной стенкой, препятствующей трансформации ДНК в клетке. Чтобы справиться с этим, ТАР-клонирование использует фермент зимолиазу, расщепляющий большую часть клеточной стенки, в результате чего образуется так называемый сферопласт, в который легче поместить большие куски ДНК{138}. В результате ТАР-клонирования получаются кольцевые искусственные хромосомы. Они стабильны, а кольцевая структура позволяет легко очищать их от нормальных линейных хромосом дрожжей.
Мы обнаружили, что с помощью ТАР-клонирования мы можем стабильно растить наши большие конструкции из синтетической ДНК, а используя дрожжевую систему гомологичной рекомбинации – соединять наши перекрывающиеся сегменты-четвертушки в куски в половину генома. Затем эта система позволит нам собрать в дрожжах весь геном