M. genitalium целиком. Таким образом перед нами замаячил конец долгого и трудного восхождения к первому синтетическому геному живого организма.
Мы вставили в дрожжевые клетки шесть кусков ДНК: ТАР-клонирующий вектор и пять соответствующих геному M. genitalium (четыре сегмента по четверти синтетического генома и еще один разделенный надвое сегмент для перекрытия мест ТАР-клонирования). Чтобы этот эксперимент сработал, надо, чтобы дрожжевая клетка приняла все шесть сегментов ДНК и гомологичной рекомбинацией соединила их между собой. Мы проверили размер ДНК в 94 трансформированных дрожжевых клетках и обнаружили, что в семнадцати из них содержится полный синтетический геном M. genitalium.
Казалось, мы преуспели в сборке нашего синтетического бактериального генома в дрожжевых клетках, но надо было еще секвенировать ДНК, чтобы проверить точность этого генома и убедиться, что процесс сборки прошел без ошибок. Это звучит просто, но нам пришлось разработать новые методы, чтобы извлечь нашу синтетическую хромосому из дрожжевых клеток, а она, по нашей оценке, составляла около 5 % всей содержащейся в них ДНК. Для очистки нашей синтетической ДНК мы, зная последовательности генома дрожжей и синтетического генома, подобрали рестриктазы, которые порезали на мелкие кусочки только ДНК дрожжей. Затем путем гель-электрофореза мы отделили расщепленные остатки дрожжевой ДНК от невредимой синтетической хромосомы.
Наконец мы могли использовать наш метод дробления для секвенирования синтетического генома. Мы все были очень довольны и вздохнули с облегчением, когда реальная последовательность ДНК точно совпала с той, что была записана у нас в компьютере, включая введенные нами водяные знаки. Мы синтезировали геном M. genitalium из 582 970 пар оснований и тем самым создали самую большую химически синтезированную молекулу с заранее заданной структурой.
Мы назвали нашу первую синтетическую хромосому M. genitalium JCVI-1.0. Мы описали наши результаты и послали их в Science 15 октября, на следующий день после моего шестьдесят первого дня рождения. Наша статья вышла на сайте 24 января 2008 года, а на бумаге – 29 февраля. Мы праздновали наш успех в создании генома, но знали, что главные задачи еще впереди: теперь надо было найти способ трансплантации первого синтетического генома в клетку, чтобы посмотреть, будет ли он функционировать как нормальная хромосома. В ходе этого клетка-хозяин должна трансформироваться в такую, где все компоненты будут произведены по инструкциям, заложенным в нашу синтетическую ДНК. И снова наши опыты будут строиться на более ранних работах и идеях целого ряда талантливых команд, работавших в течение многих предыдущих десятилетий.
Глава 7. Превращение одного вида в другой
Переход от парадигмы в кризисный период к новой парадигме, от которой может родиться новая традиция нормальной науки, представляет собой процесс далеко не кумулятивный и не такой, который мог бы быть осуществлен посредством более четкой разработки или расширения старой парадигмы. Этот процесс скорее напоминает реконструкцию области на новых основаниях, реконструкцию, которая изменяет некоторые наиболее элементарные теоретические обобщения в данной области, а также многие методы и приложения парадигмы. В течение переходного периода наблюдается большое, но никогда не полное совпадение проблем, которые могут быть решены и с помощью старой парадигмы, и с помощью новой. Однако тем не менее имеется разительное отличие в способах решения. К тому времени, когда переход заканчивается, ученый-профессионал уже изменит свою точку зрения на область исследования, ее методы и цели.
Если бы мне нужно было выбрать одну работу, статью или результат эксперимента, которые повлияли на мое понимание жизни сильнее прочих, то я, без сомнения, выбрал бы из всех остальных вот эту: «Трансплантация генома бактерий: превращение одного вида в другой»{140}. Исследование, которое привело к статье 2007 года в Science, не только сформировало мой взгляд на жизнь, но также заложило фундамент для создания первой синтетической клетки. Пересадка генома не только указала путь выполнения потрясающей трансформации, но также помогла доказать, что ДНК – это программный носитель жизни.
В известном смысле наши опыты можно считать продолжением процесса, именуемого «пересадкой ядра», который был применен, в частности, командой во главе с Иэном Уилмутом в Институте Рослин возле Эдинбурга, в Шотландии, для создания Долли{141}, клонированной овцы. Ядро из клетки молочной железы взрослой овцы со всей ДНК пересадили в яйцеклетку (предварительно лишенную собственного ядра), успешно вернув пересаженную ДНК в эмбриональное состояние. Последовавшее рождение Долли прогремело в 1997 году в заголовках прессы всего мира, потому что она была создана из взрослой клетки молочной железы (откуда и ее имя – намек на певицу Долли Партон с пышным бюстом). До рождения этого ягненка взять клетку взрослого организма и сделать клон считалось невозможным. Достижение Института Рослин опиралось на многие факторы, от изощренного знания клеточного цикла до технических решений вроде покрытия реконструируемого эмбриона оболочкой из защитного агара{142}. Но Долли была далеко не первым клоном и даже не первой клонированной овцой{143}.
История пересадки ядра на самом деле начинается в 1938 году со знаменитого и очень изобретательного немецкого эмбриолога Ханса Шпемана (1869–1941), который опубликовал результаты первых экспериментов по пересадке ядер{144}. Шпеман был первопроходцем того, что он называл Entwicklungsmechanik – «механика развития», и был в 1935 году за свои опыты награжден Нобелевской премией. Совместно с Хильде Мангольд (1898–1924) он провел первые опыты по пересадке ядра на тритонах, оказавшихся идеальным экспериментальным объектом из-за своих крупных икринок, с которыми было удобно управляться. В 1938 году Шпеман опубликовал свою итоговую книгу «Эмбриональное развитие и индукция», в которой был описан эксперимент, проведенный при помощи умелого использования микроскопа, пинцета и тонкого волоска, вероятно, вырванного у его дочери Маргретте.
Шпеман сделал из волоска петлю, чтобы разделить под бинокуляром цитоплазму только что оплодотворенной икринки саламандры, придав эмбриону форму гантели. На одном конце гантели было ядро, содержащее ДНК; на другом – только заключенная в клеточную мембрану цитоплазма, в которой было всё, что содержится в клетке вне ядра. (Нелишне напомнить, что, хотя исходно Шпеман вдохновился работой Августа Вейсмана о наследственности, всё, что было тогда[19] известно, это что тайна наследственности лежит в ядре.) После того как половинка с ядром поделилась четыре раза, став эмбрионом из 16 клеток, Шпеман развязал волосок и позволил одному из шестнадцати ядер пройти в отделенную цитоплазму в другой половине гантели, образуя новую клетку с исходным содержимым яйцеклетки и более зрелым ядром. Вновь затянув волосок, он разделил эмбрион надвое. Тем самым он продемонстрировал, что ядро, пройдя четыре деления, сохраняет способность превращаться в любой тип клеток. Таким способом Шпеман создал клон – генетически идентичную копию, которая была на несколько секунд моложе, чем другая.
Шпеман назвал этот процесс «двойникованием», и оно было отмечено в истории как первое клонирование животного, проведенное в лаборатории с помощью пересадки ядра. Он хотел пойти дальше и предложил «фантастический эксперимент» – проделать то же самое со взрослой клеткой. Но, как и многие до него, он был слишком ошеломлен и восхищен тайнами развития, чтобы поверить, что оно зависит лишь от физики и химии.
В следующем десятилетии задача Шпемана привлекла внимание Роберта Бриггса, исследователя из научно-исследовательского института при госпитале Ланкенау в Филадельфии (позже Институт онкологических исследований, а затем Онкологический центр Фокса Чейза), который изучал клеточное ядро. В 1952 году, работая с Томасом Кингом, он клонировал леопардовых лягушек, пересаживая ядро клетки. Эксперимент Бриггса и Кинга походил на то, что предлагал – и предвосхитил в своих опытах на саламандрах – Шпеман в 1938 году. Они пересадили ядро лягушачьего эмбриона ранней стадии в большую (миллиметровую) яйцеклетку обычной американской леопардовой лягушки. Полученные таким образом эмбрионы благополучно развились в головастиков. Но в ходе дальнейших экспериментов Бриггс и Кинг пришли к выводу, что по мере дифференцировки клеток потенциал развития уменьшается и получить клон из ядра взрослой клетки невозможно. Позже, в 1962 году, работавший в Оксфорде Джон Гёрдон заменил ядро яйцеклетки шпорцевой лягушки (Xenopus) на ядро зрелой специализированной клетки из кишечника головастика. Яйцеклетка развилась в клонированного головастика, а в последующих экспериментах удалось получить и взрослых лягушек{145}. Его исследование, научившее нас, что ядро взрослой специализированной клетки можно вернуть в незрелую стадию, было удостоено Нобелевской премии по физиологии и медицине в 2012 году{146}, через пятьдесят лет после его первопроходческих экспериментов.
То, что мы пытались сделать, в некоторых отношениях было намного сложнее, чем эти ранние эксперименты с пересадкой ядер, хотя они были, несомненно, весьма замечательными. Работа Шпемана была немного похожа на попытку перепрограммировать компьютер, ничего не зная о программировании, а просто скачивая что-то из интернета. В отличие от более сложных эукариотных клеток, у бактерии нет ядра – клеточной субструктуры, заключенной в мембрану. В бактериальной клетке геном плавает в густом цитоплазматическом супе вместе с прочими клеточными компонентами. Так что там просто нет клеточной органеллы, которую можно удалить хирургическим путем. С еще более сложной задачей мы столкнулись, когда хотели трансплантировать генетический материал одного вида в клетку другого, в то время как все предыдущие эксперименты с переносом ядра включали работу с одним видом, а то и с одним и тем же животным.