Когда мы начали думать над тем, как перевести синтетическую ДНК в бактерию и заменить ее собственную хромосому, то поняли, что надо разрабатывать новый метод трансплантации генома, поскольку нужно заменить весь геном вида-хозяина на вставленную голую ДНК нового вида без какого-либо смешения (рекомбинации) двух геномов. Отдельные гены молекулярщики уже десятки лет пересаживали привычно и без ограничений – например, вирусные и человеческие гены пересаживались в бактерии и дрожжи и работали там. Но насколько я знаю, никто не пытался пересадить полный геном, такая задача многим могла казаться невозможной.
Такая предвзятость часто ограничивает нашу способность испробовать новый подход или принять новые открытия. Например, микробиологи когда-то думали, что в бактериальных клетках может быть только одна хромосома. Но реальность оказалась намного интереснее – как я обнаружил в середине 1990-х, когда мы{147} секвенировали геном возбудителя холеры, массовой и опасной болезни, которая каждый год{148} поражает пять миллионов человек по всему миру, приводя к ста двадцати тысячам смертей. Разработанные нами алгоритмы для секвенирования дроблением, посредством которых компьютеры подбирали перекрывающиеся куски секвенируемой последовательности, имели специфическую особенность: они собирали геномные тексты только на основе перекрывающихся участков. У компьютеров не было априорного представления о том, сколько хромосом, плазмид или вирусов должно получиться, они только складывали подходящие фрагменты в математически обоснованном порядке. Когда мы собрали секвенированные фрагменты генома холеры, они явственно сложились в две независимые хромосомы – а не в одну, как полагало большинство. Когда мы сравнили эти две хромосомы друг с другом и с другими геномами, то обнаружили, что они очень сильно отличаются между собой.
Сделав такое открытие на холере, мы потом выявили немало видов микробов с несколькими хромосомами. Это поднимало вопрос: как эти виды обзавелись этими множественными хромосомами? Может, клетка просто случайно забрала дополнительную ДНК из лизированной клетки и новая хромосома образовалась, потому что она добавила своему новому дому какие-то важные для выживания способности? Или две древние клетки слились, образовав новый вид? У нас не было на это ответов, но меня эти идеи чрезвычайно привлекали. Большинство мыслило эволюцию видов как идущую за счет постепенного накопления единичных изменений оснований в последовательности ДНК в течение миллионов и миллиардов лет; тот или иной вид адаптируется к окружающей его среде, если случайные изменения предлагают преимущества для выживания. Мне показалось правдоподобным, что некоторые известные нам крупные эволюционные скачки происходили по крайней мере отчасти за счет приобретения дополнительной хромосомы, которая сразу добавила тысячи генов и множество новых признаков.
Теперь мы знаем, что многие продвинутые функции эукариотных клеток возникли в эволюции, когда ранние эукариотные клетки полностью вобрали в себя некоторые виды микробов, которые сначала жили с ними в симбиотических взаимоотношениях. Вероятно, самое важное событие такого рода произошло примерно два миллиарда лет назад, когда эукариотная клетка забрала к себе фотосинтезирующую бактериальную клетку, ставшую в итоге хлоропластом, в котором происходит фотосинтез у всех растений. Второй самый наглядный пример этого процесса, называемого эндосимбиоз, можно найти в «блоках питания» наших клеток – митохондриях, которые, как и хлоропласты, несут свои собственные гены и происходят от симбиотической бактерии, вероятно, сходной с современными риккетсиями[20].
Поскольку было ясно, что трансплантация геномов и целых клеток была существенной частью нашей эволюции, я был уверен, что мы сможем найти способ искусственной пересадки геномов. Для наших начальных экспериментов по трансплантации мы выбрали микоплазмы, потому что, в отличие от большинства бактерий, у них нет клеточной стенки (жесткого упругого наружного слоя), а есть лишь клеточная липидная мембрана, что упрощало внесение ДНК в клетку. Кроме того, мы уже многое знали о микоплазмах, включая последовательности их геномов и результаты работ по нокаутным генам. Я собрал новую трансплантационную команду вокруг двух ученых: Джона Гласса, который провел большую часть своей карьеры в фармацевтической компании Lilly pharmaceuticals, работая с микоплазмой, и примкнул к нам, когда компания закрыла свою антимикробную программу, и нового постдока из Франции Кароль Лартиг, у которой был опыт работы с различными видами микоплазм. Остальными ключевыми членами команды были Нина Альперович и Ремберт Пайпер.
Сначала мы хотели попытаться трансплантировать геном микоплазмы в E. coli, но хотя микоплазмы в своей ДНК используют те же четыре основания, что и все другие виды, у них кодон УГА[21] кодирует триптофан, в то время как у прочих видов УГА – это стоп-кодон, который прекращает процесс синтеза белка. Поскольку E. coli прочла бы УГА как стоп-кодон, то получились бы урезанные белки, несовместимые с созданием жизнеспособной клетки. Нам пришлось для экспериментов с пересадкой использовать другой вид микоплазмы.
В свое время мы выбрали M. genitalium для секвенирования, анализа и последующего синтеза генома, поскольку он у нее чрезвычайно мал, а мы думали, что при создании синтетического генома узким местом будет наша способность воспроизвести его химическим путем. Но теперь бы нам пришлось пожалеть о таком решении по практическим соображениям: в лаборатории M. geni-talium очень медленно растет. В то время как E. coli делится на дочерние клетки каждые двадцать минут, M. geni-talium, чтобы сделать свою копию, требуется двенадцать часов. Это может показаться не слишком большой разницей, но при экспоненциальном росте это разница между получением результатов эксперимента через двадцать четыре часа – и через несколько недель. Поэтому для первых опытов по пересадке генома мы выбрали два разных быстрорастущих вида микоплазмы, M. mycoides и M. capricolum. Оба они – условные патогены коз и, возможно, распространились, когда эти животные были одомашнены, около 10 тысяч лет назад{149}. Как возбудители серьезных болезней домашнего скота эти микробы часто выращиваются в лабораториях. Они все же не так торопливы, как E. coli: M. mycoides делится каждые шестьдесят минут, а M. capricolum – раз в сто минут.
Будучи геномной лабораторией, мы секвенировали геномы обоих видов, чтобы узнать, насколько они родственны друг другу. Мы нашли, что у M. mycoides в геноме 1 083 241 пара оснований, последовательность которых на три четверти (76,4 %) совпадает с несколько меньшим геномом M. capricolum, состоящим из 1 010 023 пар оснований. В соответствующих друг другу участках генома последовательности совпадают на 91,5 %. Оставшаяся четверть (24 %) генома M. mycoides не имеет соответствия в геноме родственного вида – она содержит последовательности, которые в геноме M. capricolum не обнаружены.
Основываясь на сходстве последовательностей ДНК, мы рассудили, что ключевые белки каждого вида, использующиеся для интерпретации генетических инструкций, будут достаточно биохимически совместимы, чтобы прочитать геном другого вида, и в то же время их можно будет легко отличить друг от друга. Мы также подумали, что геномные последовательности различаются достаточно, чтобы не рекомбинировать.
Когда дошло до выбора, чей геном пересаживать, а кто будет хозяином, мы выбрали M. mycoides в качестве донора генома и M. capricolum как реципиента: M. mycoides быстрее растет, геном у нее побольше, и это позволит легче заметить успешную пересадку. Была и еще одна техническая причина для такого решения. В своей предыдущей лаборатории Кароль Лартиг изучала особый участок ДНК – так называемый «ориджин», точку начала репликации. С этим участком связывается комплекс белков ORC, участвующий в репликации ДНК, и отсюда начинается процесс удвоения. Лартиг показала, что белки ORC M. capricolum способны узнать ориджин M. mycoides, а ORC M. mycoides не узнают ориджин M. capricolum. Таким образом, геном M. mycoides сможет удваиваться в M. capricolum – но не наоборот.
Выбрав из микоплазм донора и реципиента, мы ощутили уверенность, что наша экспериментальная система способна обеспечить наилучшие возможности для попытки трансплантации генома. Дальнейшие шаги требовали множество нудных экспериментов методом проб и ошибок и заводили нас в область неизвестного. Нам надо было разработать новые методы для выделения интактной хромосомы из одного вида и пересадки ее в другой вид, не повредив и не разрезав ДНК. Если мелкие куски ДНК легко поддаются манипуляциям без повреждений, то крупные, особенно целые хромосомы, состоящие из миллионов оснований, очень хрупки и легко повреждаются.
Нам также нужно было определиться с экспериментальным подходом в целом. Следовало ли нам удалить или разрушить геном capricolum перед тем, как мы подсадим в клетку новый от клетки mycoides? Этот процесс был бы эквивалентен энуклеации – этапу удаления ядра в эукариотных клетках, что относительно легко, так как можно просто высосать ядро микропипеткой из яйцеклетки-реципиента. Мы не знали, необходимо ли для наших целей разрушить или удалить геном клетки-реципиента прежде, чем добавить в нее новую ДНК. Как и того, что будет, если у нас в итоге в одной и той же клетке окажутся два генома.
Мы придумывали разные способы атаки на хозяйскую хромосому, включая применение радиации, чтобы уничтожить ее ДНК, рассуждая, что на ДНК низкие дозы радиации повлияют намного сильнее, чем на гораздо более мелкие молекулы белков. Мы также рассматривали использование рестриктаз, чтобы они расщепили ДНК в геноме клетки-реципиента. Но нас все время тревожило, что любой их этих подходов может оставить после себя фрагменты ДНК, которые затем могут рекомбинировать с пересаженной хромосомой, и тогда геном в клетке уже не будет чисто синтетическим. После широкого обсуждения Хэм Смит предложил идею попроще: ничего не делать, потому что, когда клетка-реципиент после трансплантации поделится, в одной из дочерних клеток может оказаться только пересаженная хромосома.