Опираясь на эту прошлую работу, мы разработали три разных подхода к клонированию полных бактериальных хромосом в дрожжах. В первом мы решили вставлять искусственный дрожжевой центромер в бактериальную хромосому перед тем, как растить ее в дрожжах. Во втором и третьем подходах мы всё делали одновременно: вставляли бактериальную хромосому и дрожжевой центромер с перекрывающимися последовательностями, что приводило к их рекомбинации в дрожжах. Все три подхода оказались вдохновляюще успешными, причем с несколькими бактериальными геномами, в том числе M. mycoides, H. influenzae и геномом фотосинтезирующей водоросли{155}. Очень интересно, что единственное, что требуется для превращения бактериальной хромосомы в дрожжевую, – это добавление вместе с пригодным для селекции маркером маленького синтетического дрожжевого центромера. Теперь у нас был метод, который мы могли использовать для проверки нескольких разных способов трансплантации генома. Научившись стабильно клонировать геном M. mycoides в дрожжевые клетки, мы разработали процедуры для извлечения интактных хромосом в трансплантируемой форме.
Чтобы проверить геном M. mycoides, пропущенный через дрожжи, мы пересадили его, как раньше, в клетки M. capricolum. Однако проделав этот эксперимент много раз, команда не смогла получить никаких измененных клеток. Они провели контрольные опыты, используя геном, выделенный непосредственно из клеток M. mycoides дикого типа, и его удалось успешно трансплантировать, как и раньше. Я ждал результатов, и ко мне пришел Хэм Смит с обескураживающим вердиктом: «Геномные транспланты из дрожжей не работают». Видимо, источником проблемы были дрожжи, которые позволяли нам манипулировать длинными кусками бактериальной ДНК.
Мы с Хэмом Смитом уже обсуждали, что может отличаться в геноме M. mycoides, выращенном в клетках M. mycoides, от такого же генома, выращенного в дрожжевых клетках, поэтому во время видеоконференции между роквильской командой и группой в Ла-Хойе мы быстро сфокусировались на самой очевидной разнице. В клетках M. mycoides ДНК специфически метилируется (украшается молекулярными довесками, называющимися метильными группами). Эти группы, производные метана, состоят из одного атома углерода и трех атомов водорода (CH3). Бактериальные клетки используют метилирование ДНК для защиты ее от нарезки собственными рестриктазами – добавляя метильные группы к тем основаниям ДНК, которые рестриктаза распознает. У дрожжей, однако, нету таких же рестриктаз и системы метилирования ДНК, а бактериальные метилазы вряд ли синтезируются в дрожжах из-за некоторых различий в генетическом коде. Мы подумали, что если геном M. mycoides в дрожжах действительно не метилируется, то при пересадке его в M. capricolum рестриктазы клеток-хозяев должны немедленно его разрушать.
Мы испробовали два подхода для проверки идеи, что причиной неудач трансплантации была неметилированность ДНК в дрожжах. В первый раз мы клонировали шесть генов, обеспечивающих метилирование ДНК у M. mycoides, чтобы получить ферменты, которые метилировали бы геном M. mycoides после выделения его из дрожжевых клеток. Этот метод оказался успешным: геном, выделенный из дрожжевых клеток, метилированный и пересаженный в бактериальные клетки, наконец заработал. Если бы мы метилировали геном M. mycoides экстрактом клеток M. mycoides или клонированными и очищенными ДНК-метилазами, то мы могли бы так же успешно пересадить их в клетки M. capricolum. Как окончательное доказательство того, что метилирование ДНК было решающим фактором, мы удалили из генома реципиента M. capricolum ген рестриктазы, рассудив, что если у клетки-реципиента нет рестриктаз, то мы сможем пересадить голую ДНК M. mycoides из дрожжей напрямую, без необходимости в защитном метилировании. В этом и было все дело, и вот теперь наконец-то мы вроде бы собрали все нужные компоненты для трансплантации синтетических хромосом.
Это краткое описание не отражает того, что решение проблемы метилирования на самом деле потребовало более двух лет тяжелого труда, но зато по ходу дела мы разработали очень мощный новый набор инструментов, который дал нам такие возможность манипулировать бактериальными хромосомами, каких не было никогда раньше. Большинство бактериальных клеток не имеет таких генетических систем, как гомологичная рекомбинация, имеющихся у дрожжей и E. coli. В результате внести серьезные генетические изменения в большинство бактериальных геномов очень трудно, если не невозможно. Это одна из причин, по которой большинство ученых работает с E. coli: они делают это просто потому, что с ней можно работать.
Однако теперь, добавив эукариотный (дрожжевой) центромер к прокариотному (бактериальному) геному, мы могли выращивать бактериальный геном в дрожжах, где он вел себя как одна из хромосом дрожжей. Это проложило путь к использованию дрожжевой системы гомологичной рекомбинации для проделывания многих и быстрых изменений в геноме. А потом мы смогли выделить модифицированный бактериальный геном, метилировать его, если необходимо, и трансплантировать в клетку-реципиент, чтобы создать новую клеточную версию. Это стало огромным прогрессом в генетических манипуляциях. До этого открытия ученые по большей части были ограничены возней с индивидуальными генами. Теперь для нас стало обычным делом оперировать наборами генов и даже целыми геномами. Мы опубликовали результаты в Science в сентябре 2009 года{156}.
К тому времени мы разработали новые способы синтезировать молекулы ДНК в двадцать раз длиннее, чем было возможно ранее; мы разработали методику трансплантации генома из одного вида в другой и создания нового вида; и мы решили проблему модификации ДНК, предотвращающей разрушение ее рестриктазами. Нас и многих из тех ученых, кто следил за нашим продвижением, интересовало, сможем ли мы в итоге преуспеть в создании клетки, основанной на синтетическом геноме. Теперь, когда мы показали, что можем перейти от дрожжей к микоплазме, следующий шаг был перейти от синтетической ДНК в дрожжах к микоплазме. Мы были готовы, скомбинировав все эти новаторские подходы, творить историю. Но ту ли микоплазму мы взяли?
Поскольку мы достигли значительного прогресса в использовании дрожжей для манипуляции большими кусками ДНК, наши команды упорно продолжали свои попытки пересадить синтетический геном M. genitalium, но довольно безуспешно. Выглядело так, будто мы могли превратить более крупный вид M. pneumonia в M. genitalium пересадкой природного генома, но не могли достичь того же результата с синтетической версией. Наконец мы обнаружили, что реципиентные клетки M. pneumonia имеют на своей поверхности какую-то нуклеазу, которая съедает любую подвернувшуюся ей ДНК.
Но нас продолжал терзать чрезвычайно медленный рост клеток M. genitalium, сильно ограничивавший число возможных экспериментов. Для всех нас, а особенно для меня, ждать результатов неделями было не просто тяжело, а прямо-таки физически мучительно. Надо было что-то менять. Занимаясь метилированием ДНК и трансплантацией, мы одновременно придумывали более быстрый способ создания синтетической ДНК, технический прием, который дал бы новые возможности в нашей затее по трансплантации синтетической бактериальной ДНК. Как я уже писал, наши начальные этапы синтеза ДНК требовали нескольких шагов, начиная со сборки коротких олигонуклеотидов в конструкции покрупнее. Однако Дэн Гибсон чрезвычайно упростил этот метод, так что теперь у нас был одноступенчатый процесс.
Реакции сборки ДНК, которые использовал Дэн для своего нового метода, были очень сходны с теми, которые мы задействовали в нашей предыдущей работе, за исключением того, что он сделал важное открытие: все они могут проходить в одной пробирке и при одной температуре. Дэн сообразил, что экзонуклеазы, укорачивающие одну цепочку ДНК, не конкурируют с ДНК-полимеразой, которую мы использовали, чтобы дополнить ДНК второй цепочкой. Кроме того, когда все ферменты скомбинированы в одной реакционной смеси при 50 ºС, экзонуклеаза при такой температуре быстро инактивируется и поэтому может откусить как раз столько оснований, чтобы позволить фрагментам ДНК сплавиться друг с другом.
Эта работа была огромным прорывом по сравнению с нашим предыдущим подходом, нудным и трудоемким. Сила этой «Гибсоновой сборки», как мы ее назвали, – в ее великой простоте. До нее мы неохотно думали о повторении марафонских усилий, которых потребовало создание нашей первой синтетической хромосомы M. genitalium JCVI-1.0, из десяти тысяч кусков ДНК, не говоря уж о чем-то побольше. Исходно мы полагали, что самой трудной для решения проблемой будет химия синтеза генома; теперь же развитие технологии синтеза убедило меня в том, что надо существенно поменять направление программы.
Я поговорил с Хэмом Смитом и сказал, что мы неправильно подошли к проблеме. Поскольку мы, видимо, никогда не будем успешно работать – а скорее только мучиться – с медленно растущей M. genitalium, я сказал ему: «Я хочу, чтобы мы остановили все работы на ней и применили наши новые технологии для синтеза генома M. mycoides». Это было довольно нахальное требование, потому что геном mycoides вдвое больше genitalium. Но к этому времени мы знали, как пересаживать геном M. mycoides из дрожжей и как сделать клетки M. mycoides из клеток M. capricolum; а вооружившись сборкой Гибсона, мы теоретически могли собрать геном в 1,1 миллиона пар оснований относительно быстро.
Поначалу я столкнулся с сильным сопротивлением своей команды, и задним числом я не удивляюсь, что они приняли в штыки это радикальное предложение – не только начать всё сначала, но еще и нацелиться на более амбициозный объект. Дэн Гибсон, понятное дело, согласился с моим изменением плана, в то время как Хэм Смит и остальная команда хотели двигаться по прежнему пути, со знакомым набором проблем, но сконцентрироваться на поиске путей их разрешения, даже если это значило продолжать мучиться с медленно растущими клетками