genitalium. Однако после нескольких раундов обсуждения, давших всем достаточно времени, чтобы обдумать мою идею, мнения стали меняться. Хэм пришел ко мне и сказал, что он согласен, что нам надо сменить направление; мы сразу же позвонили Дэну Гибсону и сказали ему, чтобы он начинал синтезировать геном M. mycoides.
Одной из причин, по которой команда сначала воспротивилась этому новому подходу, было то, что у нас в тот момент не было точной последовательности генома M. mycoides. Мы начали проектирование и синтез с того, что быстренько секвенировали две цепочки. Две наших последовательности генома из изолятов M. mycoides отличались друг от друга в 95 местах. Поскольку дрожжи теперь играли центральную роль в сборке синтетических геномов, мы выбрали последовательность из того изолята, который уже успешно клонировали в дрожжах и пересаживали в клетки-реципиенты.
Мы начали с проектирования 1078 кассет, каждая из которых включала 1080 пар оснований и перекрывалась с соседними на 80 пар.
Чтобы иметь возможность вырезать собранные последовательности из векторов, в которых они росли, мы добавили к кассетам еще одну последовательность на восемь оснований, опознаваемую рестриктазой NotI как место резки. Мы также добавили четыре «водяных знака», чтобы отличать наш синтетический геном от любых естественно возникших разновидностей. «Водяные знаки» занимали от 1081 до 1246 пар оснований; в них специально разработанным кодом были зашифрованы цифры и английские слова. Мы позаботились вставить последовательность «водяных знаков» в те участки генома, где они, как мы показали экспериментально, не повредили бы жизнеспособности клетки. Закончив проектирование, мы заказали 1078 кассет в Blue Heron, одной из первых ДНК-синтезирующих компаний, расположенной в Ботелле, штат Вашингтон. Компания собрала сегменты по 1080 пар оснований из химически синтезированных олигонуклеотидов, секвенировала их, чтобы убедиться, что они отвечают нашим спецификациям, и отправила их нам.
Теперь мы могли начать конструирование синтетического организма всерьез. Мы использовали иерархическое конструирование, которое шло в три этапа. На первом мы с помощью Гибсоновой сборки построили из кассет по 1080 пар оснований серию из 111 более длинных кассет, каждая около 10 тысяч пар оснований. Как всегда, точность была превыше всего, поэтому мы секвенировали все 111 и в девятнадцати нашли ошибки. Эти ошибки последовательностей были исправлены, после чего 10-килобазные клоны были пересобраны и пересеквенированы, чтобы проверить, правильные ли они.
Во втором раунде сборки генома мы собрали перекрывающиеся кассеты по 10 килобаз, чтобы сформировать кассеты по 100 000 пар оснований (которые мы тоже секвенировали, чтобы проверить свою точность). Наконец мы собрали получившиеся одиннадцать кассет по 100 кб вместе в дрожжах, чтобы получить последовательность в 1,1 миллиона пар оснований генома M. mycoides. Нам надо было еще раз проверить, что сборка работает, и мы использовали ПЦР и переваривание рестриктазами, чтобы подтвердить, что геном у нас построен правильно.
Наконец мы были готовы к попытке создания первой синтетической клетки посредством пересадки полного синтетического генома M. mycoides из дрожжей в реципиентные клетки M. capricolum. Как и раньше, успех должны были возвестить голубые клетки. Первая пересадка была проделана в пятницу, и мы напряженно ждали весь уикенд, чтобы посмотреть, не появятся ли к утру понедельника голубые клоны. Но понедельник пришел и прошел, не принеся никаких положительных результатов. Пересадку повторяли в две следующие пятницы, но снова никаких голубых колоний, только хмурые понедельники.
При взгляде назад ясно, что мы были очень близки к успеху, хотя тогда мы этого не чувствовали. После проведения всех контролей мы пришли к выводу, что мимо всех проверок, которые мы делали во время синтеза генома, как-то проскользнула ошибка в замысле или последовательности. Поскольку мы секвенировали ДНК, то предположили, что ошибка должна была быть в одной из исходных последовательностей, которые мы взяли за образец генома. Чтобы проверить наши последовательности, нам надо было создать биологический эквивалент того, что разработчик компьютерных приложений определил бы как отладочную программу. Операционная система современного компьютера обширна, в ней десятки миллионов строк кода{157}, и в течение десятков лет инженеры разрабатывали умные отладочные программы, чтобы помочь находить ошибки.
Работу нашего биологического отладчика мы решили начать с проверки одиннадцати сегментов по 100 000 пар оснований. Мы сделали сегменты того же размера из природного генома M. mycoides так, чтобы можно было поочередно подставлять вместо каждого из них синтетический сегмент и смотреть, смогут ли они поддерживать жизнь. Из этих сложных экспериментов мы выяснили, что из одиннадцати синтетических сегментов по 100 килобаз все, кроме одного, совместимы с жизнью. Для окончательного доказательства Дэн Гибсон сконструировал гибридный геном с десятью синтетическими сегментами и одним природным и получил успешные трансплантаты.
Установив, который сегмент содержал ошибку или ошибки, несовместимые с жизнью, мы секвенировали ДНК еще раз – теперь высокоточным методом по Сэнгеру – и выяснили, что там выпала одна пара оснований. В таких случаях тривиальное сравнение нуклеотидов с буквами несколько сбивает с толку: кажется, что это так же мало влияет на понимание текста, как, скажем, написание «ошбка» вместо «ошибка». Но дело в том, что текст ДНК читается тройками нуклеотидов, каждой аминокислоте в белке соответствует комбинация из трех оснований – кодон. Это означает, что выпадение одного основания меняет всю дальнейшую генетическую последовательность: разбиение на кодоны в ней будет совсем другим, а значит, другой будет и последовательность аминокислот, которую этот участок ДНК кодирует. Это называется «мутация со сдвигом рамки»; в данном случае сдвиг произошел в важном гене dnaA, который способствует раскручиванию ДНК в начале репликации – без этого ДНК не может удвоиться. Это выпадение одного-единственного основания препятствовало клеточному делению и поэтому делало жизнь невозможной. Когда мы нашли критическую ошибку, мы смогли пересобрать сегмент в 100 кб правильно и использовать дрожжи для пересборки всего генома целиком. Теперь мы опять были готовы к попытке пересадки генома.
Как и раньше, решающий эксперимент был начат в пятницу, чтобы успешные колонии имели достаточно времени для роста и к следующему понедельнику выглядели бы как голубые точки. Дэн Гибсон сообщил нам имейлом о последней попытке:
Крейг, Хэм, Клайд, Джон, полный синтетический геном (с четырьмя водяными знаками и без мутации в dnaA) был трансплантирован сегодня. Геном выглядит потрясающе. Он проанализирован на мультиплексе ПЦР на все 11 соединений и четыре водяных знака. Его также проверили рестриктазами и анализом FIGE[22]. Одновременно с ним трансплантировали два клона из дрожжей с полусинтетическими геномами 10/11[23]. Эти геномы были проанализированы, как и вышеупомянутый, и тоже выглядят отлично. Я пошлю мейл утром в понедельник, но имейте в виду, что колонии появлялись позже, чем обычно, так что мы можем не получить ответа до вторника.
В пятницу после обеда Дэн вручил маленький флакон своей коллеге Ли Ма, которая сидела под колпаком биозащиты – в одном из закрытых рабочих мест с сепараторным фильтром, которые мы использовали в наших лабораториях для работы в стерильных условиях. Флакон содержал маленький кусочек агарозы, в котором находилось несколько миллионов крохотных кольцевых ДНК – хромосом, каждая из которых содержала наш синтетический геном из 1 078 809 пар оснований. Это была синтетическая ДНК с 886 генами M. mycoides и с нашими «водяными знаками». Ли добавила капли фермента, который должен был растворить гель и оставить синтетические геномы, которые она затем добавила в другой маленький флакон, с реципиентными клетками M. capricolum и полиэтиленгликолем, делающим мембраны проницаемыми для ДНК. Ли распределила клетки на чашке Петри с красным агаром – составом, который будет питать новые клетки сахаром и аминокислотами. В агар был также добавлен тетрациклин, чтобы убить все клетки-реципиенты, которые не примут синтетический геном, и краситель X-gal, от которого новые клетки, содержащие трансплантированный геном, станут ярко-голубыми. Ближе к вечеру Ли поставила чашки Петри в инкубатор, чтобы держать клетки при постоянной температуре 37 градусов. Если новые клетки получились, то им понадобится пара дней, чтобы поделиться нужное число раз для превращения в один миллион дочерних клеток – маленькую колонию, видимую невооруженным глазом.
Все выходные я психовал. Тот миг, когда мы должны были увидеть, успешны ли наши модификации генома, казалось, отъехал в бесконечность. Наконец, очень ранним утром понедельника Дэн Гибсон трясущимися от предвкушения руками открыл дверцу инкубатора и начал по одной вынимать чашки Петри. Оставив лучшее на потом, он начал с контрольных (тех, которые должны были показать, что Ли Ма следовала правильной процедуре) и осматривал каждую на свет, чтобы проверить, видны ли уже колонии. Затем он перешел к тем, что содержали синтетическую ДНК. И там, почти в центре одной чашки, была одна – и только одна – ярко-голубая колония клеток.
Дэн остановился, чтобы оценить значительность момента. Поглядев на чашки Петри несколько минут, он поставил их все обратно в инкубатор и послал мне в четыре утра по Роквиллю простое сообщение: «У нас есть голубой трансплантат». Мы прошли такой долгий путь, потерпели столько неудач, столько лет ушло на пробы и ошибки, на решение проблем и изобретения. Наконец, кажется, усилия окупились.