BARDA), может в итоге обеспечить более эффективный ответ и на сезонные, и на пандемические вспышки гриппа.
В настоящее время Novartis и другие компании – производители вакцин в идентификации и раздаче вакцинных вирусов полагаются на ВОЗ. Чтобы ускорить процесс, мы используем метод «обратной вакцинологии», который впервые применил для разработки менингококковой вакцины Рино Раппуоли, ныне работающий в Novartis. Основная идея состоит в том, что весь патогенный геном вируса гриппа можно обследовать при помощи биоинформационного подхода к идентификации и анализу его генов. Далее выбирают конкретные гены, продукт которых может стать хорошей целью для вакцины – например, белки капсулы. Эти белки затем подвергают обычному тестированию на иммунный ответ.
Моя команда секвенировала гены, представляющие разнообразие вирусов гриппа, появлявшихся начиная с 2005 года. Мы секвенировали полные геномы большой коллекции изолятов человеческого гриппа, а также избранных штаммов птичьего и других нечеловеческих гриппов, важных для эволюции вирусов с пандемическим потенциалом, и сделали эту информацию доступной для всех. Штаммы выбирали так, чтобы они представляли много подтипов с широким географическим и хронологическим распределением. В результате нашего сотрудничества Novartis и SGI разработают «банк» искусственно сконструированных вакцинных вирусов, которые можно пускать в производство сразу же, как только ВОЗ установит циркулирующие штаммы гриппа. Эта технология может сократить время на производство вакцины до двух месяцев, что будет существенным выигрышем в случае пандемии.
Стандартное производство вакцины от гриппа занимает много времени. Важный этап, ограничивающий скорость, – это промежуток между выделением штамма (когда ВОЗ и CDC установят циркулирующий штамм(ы) и выпустят глобальную рекомендацию по созданию вакцинного вируса, специфического для данного гриппа) – и собственно производством вакцины. Традиционный метод производства основан на выращивании вируса в оплодотворенных куриных яйцах. В целом на процесс требуется около тридцати пяти дней, куда входят тестирование и распределение эталонного вируса, одновременное заражение яиц стандартными опорными штаммами и изоляция и очистка посевного материала вакцины. Воспользовавшись главными достижениями синтетической биологии и клеточного производства и добавив захватывающую идею цифро-биологического преобразования, мы с Novartis произвели вакцину лучшего качества менее чем за пять дней.
Вакцина основана на белках вирусного конверта – гемагглютинине (HA), который образует шипы, позволяющие вирусу гриппа прикрепляться к клеткам-мишеням, и нейраминидазе (NA), которая образует головки на поверхности вирусных частиц и катализирует их выход из зараженных клеток, позволяя вирусу рассеваться. Когда были получены высокоточные синтетические гены HA и NA, следующим шагом стало «спасение» прототипа вакцины путем комбинирования HA и NA со щепоткой других генов в геном вируса гриппа, который имеет программу для изготовления всего одиннадцати белков. Мы применили обратный генетический подход на новартисовской клеточной линии MDCK (собачья почка Мадин-Дарби), одобренной Управлением по контролю за продуктами питания и лекарствами США (FDA) в 2012 году в качестве замены яиц при производстве вакцины от гриппа. Клетки были заражены линейными синтетическими кассетами, кодирующими вирусные гены. Через 72 часа после трансфекции (изменения клетки вирусной ДНК) в среде клеточной культуры можно было заметить вирусы гриппа и выделить нужный штамм вируса для дальнейшей амплификации и конечного использования как источника вакцины.
Предварительные испытания совершенства и надежности технологии производства синтетических источников вакцин прошли 29 августа 2011 года. За основу были взяты последовательности генов HA и NA низкопатогенного североамериканского штамма птичьего гриппа H7N9, полученного у CDC и предоставленного BARDA. Синтез олигонуклеотидов стартовал в восемь утра. К полудню 2 сентября, ровно через четверо суток и четыре часа от начала процедуры, вакцинный штамм был получен. После завершения этой подтверждающей демонстрации процесс был успешно повторен на множестве других штаммов и подтипов гриппа, в том числе на H1N1, H5N1 и H3N2. Ко времени написания этой главы штаммов, которые нельзя было бы собрать и «спасти» искусственно, больше не осталось.
Проект синтетического гриппа теперь входит в следующую важную фазу развития. Быстрое и эффективное производство материала для вакцин дает возможность гораздо лучше подготовиться к пандемии – в сочетании с пониманием того, как вирус эволюционирует. Вирусы гриппа динамичны и меняются двумя основными способами: антигенный дрейф и антигенный сдвиг. Дрейф, который происходит постоянно, означает небольшие постепенные изменения, которые происходят за счет точечных мутаций в двух генах, кодирующих главные поверхностные белки – упоминавшиеся выше гемагглютинин и нейраминидазу. Антигенный сдвиг означает резкое крупное изменение, приводящее к появлению совершенно нового вируса гриппа – путем прямой передачи его к людям от животных (обычно от свиней или птиц) или через генетическую реассортацию, т. е. смешивание генов человеческого гриппа А с гриппом животных А, в результате чего получается новый подтип человеческого вируса гриппа А. Наблюдая и и анализируя сдвиги штаммов гриппа и вновь возникающие штаммы, мы можем начинать готовиться к наиболее вероятным штаммам, а не только спешно реагировать, когда вспышка уже станет фактом. Для штаммов, которые представляют потенциальную угрозу, вакцинный материал можно делать заранее и хранить в банках вакцинных штаммов, доступных и готовых к использованию, когда понадобятся.
Подготовка к будущей пандемии идет полным ходом. Создается всеобъемлющая база данных, которая будет включать данные секвенирования прошлых гриппов, антигенные вариации и характеристики роста штаммов, и в нее уже внесены почти 66 000 выделенных последовательностей и 33 000 наборов данных по парам антигенов. Разрабатываются продвинутые алгоритмы для предсказания изменений соотношения субпопуляций циркулирующего вируса во времени, чтобы автоматически оценивать, какая вакцина (или кандидат в вакцины) даст наилучшую защиту, и улучшать возможности предсказания отбора штаммов.
Другой критический шаг к продвинутым вакцинам от гриппа на синтетической основе – это наращивание объема синтетического вакцинного материала и включение его в технологический процесс для перехода к коммерческому производству вакцин. Novartis начинает воплощать это в реальность – реальность, чрезвычайно важную для ответа на глобальную пандемию. Скорость, легкость и точность, с которыми синтетические технологии позволяют производить «высокоурожайные» вакцинные штаммы гриппозных вакцин, обещают не только более быстрые ответы на будущие пандемии, но и более надежное снабжение вакцинами от пандемического гриппа.
Хотя вакцины – это лучшие средства предотвращения пандемий, и синтетическая биология помогла нам сделать их более эффективными, мы теперь сталкиваемся с другой большой инфекционной угрозой, поскольку одно из важнейших орудий человечества в борьбе с болезнями, антибиотики, быстро теряют свою эффективность. Мы наслаждались перемирием в исторической войне с микробами с середины прошлого века, после случайного открытия пенициллина британским микробиологом Александром Флемингом (1881–1955) в 1928 году и разработки технологии массового производства этого лекарства австралийцем Ховардом Уолтером Флори (1898–1968) вместе с немцем Эрнстом Борисом Чейном (1906–1979) и английским биохимиком Норманом Хитли (1911–2004){245}. Флори и Чейн разделили с Флемингом Нобелевскую премию за 1945 год по медицине за их далеко идущую работу. В последние восемьдесят лет антибиотики использовались для лечения многих ранее смертельных инфекционных болезней, спасая миллионы жизней, и чрезвычайно расширили применение хирургии – вообразите без них хотя бы попытку удаления аппендикса, не говоря уж об операциях на сердце, почке или бедре.
Хотя это семейство лекарств колоссально повлияло на увеличение продолжительности жизни, с самого начала микробы, на которых оно было нацелено, начали отбиваться. Вскоре после того, как пенициллин применили для лечения солдат на Второй мировой войне, бактерии нашли пути сопротивления этому распространенному антибиотику. Понять, как бактерии могут не обращать внимания на тот или иной антибиотик, помогли элегантные эксперименты, проведенные в Висконсинском университете Джошуа Ледербергом (1925–2008), которого вдохновила на изучение генетики бактерий плодотворная статья 1944 года Эвери, Маклеода и Маккарти, определившая ДНК как «источник трансформации». Работая вместе с женой, Эстер Циммер Ледерберг, он показал, что линии бактерий, устойчивых к пенициллину, существовали до того, как пенициллин стали использовать для лечения, – это было частью важных исследований, за которые он получил Нобелевскую премию.
Чтобы нейтрализовать действие антибиотиков, устойчивые штаммы используют широкий спектр белков. Такие антибиотики, как тетрациклин и стрептомицин, привязываются к особому участку рибосомы, нарушая синтез белка, и один из эволюционных ответов микробов – смастерить такие рибосомы, с которыми антибиотик не сможет связаться. Некоторые микробы развили «откачивающие помпы» – белки, выбрасывающие антибиотик наружу раньше, чем он успеет подействовать. Некоторые устойчивые штаммы закутываются в непроницаемые оболочки. Иные микробы даже «едят» антибиотики{246}. Механизмов устойчивости столько{247}, что кое-кто поговаривает даже о «резистоме»{248}.
Поскольку бактерии делятся очень быстро, любые устойчивые штаммы скоро начинают преобладать в популяции. Они используют и другой механизм распространения резистентности: они могут меняться программами ДНК в ходе горизонтального переноса генов. Ледерберг показал один из способов, которым они могут это делать: через межклеточные контакты или формирование цитоплазматических мостиков