J. Struct. Biol., 1999, 128, 3-14; DOI: 10.1006/jsbi.1999.4172). Хотя биомолекулы с этим значением молекулярной массы пока еще никому не удалось изучить, и самой тяжелой молекулой, строение которой помог изучить электронный микроскоп, является молекула гемоглобина с молекулярной массой 64 кДа (Nature Comm., 2017, 8, 16099; doi:10.1038/ncomms16099), разрешение, с которым удается изучить строение некоторых молекул, уже составляет величину, меньшую, чем 2 Ангстрема.
Второй из Нобелевских лауреатов 2017 года, Иоахим Франк, еще в середине 1970-х годов стал заниматься фундаментальной проблемой изучения неконтрастированных, некристаллических асимметрических частиц, случайным образом ориентированных в растворе (Ultramicroscopy, 1975, 1, 159–162; DOI: 10.1016/S0304-3991(75)80020-9). Его работа стала основой для дальнейших исследований. Основным способом решить задачу Франк полагал: «…создание условий для выравнивания тех признаков частиц, сигналы которых могут быть четко различимы на фоне значительных шумов…».
В 1977 году Франк с коллегами описал количественный подход, способный обеспечить такое выравнивание с помощью взаимной корреляции сигналов от различных частиц (Ultramicroscopy, 1977, 2, 219–227; DOI: 10.1016/S0304-3991(76)91385-1). Был сделан вывод о том, что существует возможность определить неупорядоченное расположение исследуемых частиц с помощью пучков электронов, мощность которых недостаточна для разрушения самих объектов, и далее выстроить изображение с высоким разрешением, усредняя сигналы, полученные от каждой отдельно взятой частицы. Правомерность такого вывода была продемонстрирована при изучении строения фермента глутаминсинтетазы (Ultramicroscopy, 1978, 3, 283–290; DOI: 10.1016/S0304-3991(78)80038-2).
В принципе, в идеале для некристаллических образцов, состоящих из одинаковых частиц, требовалось не так уж много информации, описывающей их положение в условной плоскости и ориентацию в трёхмерном пространстве — для решения математической задачи, определяющей эти вопросы, требуется определить всего пять параметров. Однако реальные биологические системы отличаются от идеализированной математической модели тем, что образующие их частицы редко бывают однородными по строению, да и содержат примеси. Это приводило к необходимости создания уточнённых математических моделей, тех, которые учитывают неоднородность изучаемой системы и создания алгоритмов, позволяющих сортировать результаты исследования объекта, учитывая то, какие сигналы использовать далее для построения усреднённой картины, а от каких избавляться. В 1981 году Франк с коллегами описал метод, позволяющий сортировать образы частиц на основании их ориентации и особенностей строения (Ultramicroscopy, 1981, 6, 187–194; 10.1016/0304-3991(81)90059-0). В последующих работах Франк оптимизировал и во многом уточнил методы математического анализа, позволяющие отделить зёрна полезной информации, полученной в ходе электронной микроскопии, от неизбежных плевел. В 1981 году он обобщил математические модели в компьютерной программе SPIDER (System for Processing Image Data from Electron microscopy and Related fields — Система для Обработки Данных Электронной микроскопии и Связанных областей, первая публикация: Ultramicroscopy, 1981, 6, 343–357; DOI: 10.1016/S0304-3991(81)80236-7). Этот программный пакет для обработки изображений, полученных с помощью электронной микроскопии, существует и обновляется до сих пор (https://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html), более того — эти программы свободны к распространению, что, безусловно, облегчает работу учёных во всём мире.
Как уже говорилось выше, ожидалось, что быстрое охлаждение избавит электронную микроскопию от целого ряда ограничений и позволит применять её к биомолекулам. Предполагалось, что проблемы, связанные с образованием кристалликов льда, удастся преодолеть с помощью быстрой заморозки, благодаря которой вода будет превращаться не в кристаллическую, а стеклообразную твердую фазу. Однако до 1980-х годов сама принципиальная возможность получения твердой стеклообразной воды была дискуссионной — предполагалось, что скорость охлаждения, необходимая для превращения воды в «правильное» агрегатное состояние, никогда не будет достигнута.
В 1980 году дискуссии на тему стеклообразного состояния воды были закрыты — исследователям удалось заморозить микрометровые капли воды, переведя её в стеклообразное состояние (Nature 288, 1980, 569–571; DOI: 10.1038/288569a0). Годом позже Жак Дюбоше и Алесдер МакДауэлл продемонстрировали метод, позволяющий получить тонкую плёнку твердой некристаллической воды для заморозки образцов и их последующего изучения с помощью электронной микроскопии (J. Microsc., 1981, 124, 3–4; DOI: 10.1111/j.1365–2818.1981.tb02483.x).
Предложенный метод заключался в следующем: воду распыляли на углеродную плёнку, поверх которой была размещена сетка, которую быстро погружали в жидкий этан или пропан с температурой около -190 °C, которая поддерживалась за счет охлаждения жидким азотом. Как было показано, тонкий слой стеклообразной твёрдой воды демонстрировал однородное поглощение электронов в процессе изучения криоэлектронной микроскопии. От аморфного состояния воды к кристаллическому можно было перейти, нагревая образец до -140 °C. В последующие годы Дюбоше усовершенствовал метод заморозки и приготовления образца для электронной микроскопии, а также описал результаты подробных исследований чистой воды, водных растворов и суспензий бактериофагов и молекул ДНК при криогенных температурах (J. Microsc., 1982, 128, 219–237; DOI: 10.1111/j.1365–2818.1982.tb04625.x).
Полностью потенциал метода Дюбоше был оценен в 1984 году, когда его группа опубликовала электронные микрографии суспензий вирусов (Nature, 1984, 308, 32–36; DOI: 10.1038/308032a0). Использованная для получения этих микрографий методика позволяла получать слои воды достаточно тонкие для быстрого превращения воды в стеклообразное состояние, но при этом достаточно толстые для того, чтобы в этом слое мог поместиться монослой биологически активных молекул или молекулярных комплексов в их естественной конформации.
Достижения электронной (в том числе и криоэлектронной) микроскопии последнего десятилетия связаны с улучшением конструкционных элементов электронных микроскопов — сейчас в них применяются новые детекторы, позволяющие уверенно детектировать меньшее количество электронов, новые электронные пушки (источники электронов) и новые камеры, позволяющие практически исключить влияющие на точность микроскопического исследования колебания температуры. Вся эта модернизация, произошедшая уже в XXI веке, позволила и значительно повысить соотношение сигнал-шум, что дает возможность получать более детальные результаты анализа, и увеличить скорость анализа образца, в результате чего отдельные микрографии объектов можно склеить в «фильм» из их жизни. Всё это, как и предполагал Хендерсон в прошлом веке, действительно превратило электронную микроскопию в распространённый и доступный метод исследования, применяющийся повсеместно — от материаловедения до исследования биологических систем. Можно отметить, что настоящий расцвет криоэлектронной микроскопии как метода для изучения биологических систем начинается с 2012-13 годов и связан с появлением прямых электронных детекторов, применение которых, например, позволило в деталях изучить ионный канал клеточной мембраны TRPV1 (Nature 504, 2013, 107–112: DOI: 10.1038/nature12822). И, наконец, в этом, 2017 году, спустя почти шесть десятилетий после кристаллографического определения строения миоглобина и гемоглобина Джоном Кендрю и Максом Перутцом (именно благодаря этой работе в 1962 году они стали Нобелевскими лауреатами) и спустя четыре года после опубликования первых работ, ставших основой для разработки метода криоэлектронной микроскопии высокого разрешения, электронный микроскоп позволил определить структуру гемоглобина — криоэлектронная микроскопия позволила исследовать одну молекулу гемоглобина, к тому же находящуюся в растворе (Nature Comm., 2017, 8, 16099; doi:10.1038/ncomms16099).
Чем плохи другие методы, например — рентгеноструктурный анализ и ядерный магнитный резонанс?
Известные до криоэлектронной микроскопии и применяющиеся и сейчас методы изучения вещества, в том числе и живого вещества, нельзя назвать плохими, криоэлектронная микроскопия не отменяет, а дополняет их. Более того, как знает любой химик — чем большим количеством методов установлена структура того или иного вещества или системы веществ, тем более надёжными являются результаты исследования. Многие из классических методов позволяют получить исчерпывающую информацию о белках, нуклеиновых кислотах, а в ряде случаев — о молекулярных комплексах, образуемых биологически активными молекулами. Проблема заключается не столько в самих классических методах, сколько в подготовке образцов для исследования. Подготовить пробу для её изучения с помощью криоэлектронного микроскопа несколько проще — можно сказать, что в этом случае способ подготовки пробы заключается в приготовлении водного раствора чистого образца биологически активного вещества
Так, считающийся в настоящий момент главным доказательным методом в химии рентгеноструктурный анализ (РСА) также позволяет получать изображения биологически активных молекул с очень высоким разрешением и значительной степенью детализации — зачастую его сравнивают со способом, позволяющим «сфотографировать» молекулу, определив положение атомов в её составе с точностью до одного ангстрема. Более того, за изучение белков и нуклеиновых кислот методом рентгеноструктурного анализа была присуждена не одна Нобелевская премия. Наиболее известна Нобелевская Премия по физиологии и медицине 1962 года, которую получили Джеймс Уотсон, Френсис Крик и Морис Уилкинсон, которые установили двуспиральное строение ДНК именно с помощью рентгеноструктурного анализа. Любопытно, что в этот же 1962 год лауреатами «химической» Нобелевской премии стали Макс Пер